Способ обнаружения и оценки жизнеспособности лимфотропных вирусов

Настоящий способ обнаружения лимфотропных вирусов предназначается:


- для повышения достоверности определения инфицированности биологических сред вирусом гепатита В (HBV), вирусом гепатита С (HCV) или вирусом иммунодефицита человека (HIV), обладающих лимфотропизмом; - для исключения ложноотрицательных реакций при тестировании донорской крови и пациентов на предмет зараженности HBV, HCV или HIV; - для обнаружения HBV, HCV или HIV в биологическом материале (донорская кровь, плазма и другие производные крови) с концентрацией вирусных частиц ниже порога чувствительности метода ИФА и ПЦР; - для оценки жизнеспособности вирусов после воздействия химических и физических противовирусных факторов, разрабатываемых и предлагаемых производителями в целях инактивации вирусов в практическом здравоохранении.
Данный способ не имеет аналогов.

ПРЕЗЕНТАЦИЯ СПОСОБА

Область применения

Способ обнаружения и оценки жизнеспособности лимфотропных вирусов рекомендуется для применения в диагностических лабораториях различного уровня, станциях по заготовке донорской крови и её компонентов, при контроле противовирусного эффекта химических и физических факторов.

ВВЕДЕНИЕ

Вирусы гепатита В (HBV), гепатита С (HCV) и вирус иммунодефицита человека — ВИЧ (HIV) являются антропонозными вирусами — поражают клетки только организма человека и, поэтому, вызывают заболевание только у человека. Экспериментальные модели этих инфекций не существуют. Также нет культивируемых клеточных культур, на которых in vitro можно было бы адекватно изучить цитопатогенные свойства и жизнеспособность этих вирусов.

Характеристика вирусов гепатита В, гепатита С и ВИЧ.

Вирус гепатита В (HBV) является ДНК содержащим вирусом, его репликация происходит преимущественно в гепатоцитах человека. Вирус гепатита В также обладает лимфотропными свойствами — способностью поражать и реплицироваться в лимфоцитах человека.
Вирус гепатита С (HCV) является РНК содержащим вирусом, обладающим свойством поражать и реплицироваться как в гепатоцитах, так и в лимфоцитах человека.
Вирус иммунодефицита человека (HIV) относится к оболочечным ретровирусам и является РНК-содержащим вирусом. Основными клетками-мишенями для поражения и репликации являются CD4 лимфоциты.
Следовательно, общим свойством HBV, HCV и HIV является их лимфотропизм — способность проникать и реплицироваться в лимфоидных клетках.

II ПРЕДПОСЫЛКИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СПОСОБА ОБНАРУЖЕНИЯ И ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЛИМФОТРОПНЫХ ВИРУСОВ HBV, HCV И HIV.

Исследования по изучению вопросов клиники, патогенеза, лечения и диагностики хронических вирусных гепатитов, проведенные сотрудниками лаборатории по изучению хронического инфекционного процесса (зав. проф. Гулямов Н.Г.) НИИЭМИЗ МЗ РУз, а также анализ многочисленных данных научной литературы позволили выявить, что при хронических HBV- и HCV- инфекциях выраженность вторичного иммунодефицита не имеет закономерной корреляции с характером и выраженностью воспалительных и деструктивных процессов в ткани печени. Наряду с этим имеются единичные сообщения о возможности персистирования HBV и HCV, как и HIV, в мононуклеарных клетках крови, в частности в лимфоцитах и макрофагах. Однако, оценке данного факта с позиций патогенеза и клиники вирусных гепатитов ни одним исследователем не уделено внимания.

Было получено, что при HBV- и HCV-инфекциях одновременно развиваются воспалительные процессы в печени со всеми вытекающими из этого признаками гепатита, а также вторичное иммунодефицитное состояние, выражающееся в различной степени Т-лимфопении и В-лимфопении, в диспропорциях регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперов и Т-супрессоров), в снижении иммунорегуляторного индекса (ИРИ), а также в явлениях дисгаммаглобулинемии. Степень и выраженность иммунодефицита при этом не имели закономерной взаимосвязи со степенью выраженности патологического процесса в печени. У больных с хроничесими HBV- и HCV-инфекциями по истечении времени интенсивность прогрессирования патологического процесса в ткани печени может быть различной — от слабого до выраженного, но, независимо от этого, происходит стабильное и неуклонное усугубление вторичного иммунодефицита.

Диссоциация степени поражения ткани печени и глубины вторичного иммунодефицита при различных нозологических формах хронических вирусных гепатитов дали основание предположить, что гепатит и вторичный иммунодефицит при HBV- и HCV-инфекциях являются процессами сочетанными, взаимно усугубляющими, но не являются взаимно обуславливающими: то есть, HBV и HCV наряду с гепатотропностью обладают и выраженным лимфотропным свойством – неопосредованным свойством формировать вторичный иммунодефицит. При этом, различия в клинических проявлениях поражения ткани печени и глубины иммунодефицита при HBV- и HCV-инфекциях обуславливается различиями в степени выраженности гепатотропных и лимфотропных свойств этих вирусов. Именно различия в степени выраженности гепатотропного и лимфотропного свойств вирусов обуславливают различия патогенеза, клинических проявлений и характера эффекта противовирусной терапии при хронических HBV- и HCV- инфекциях в различные сроки давности болезни.

Анализ классических представлений о клинике и исходах различных заболеваний вирусной этиологии у человека позволил выявить закономерность: циклическое течение с полной элиминацией возбудителя и исходом выздоровление закономерно характерно для заболеваний, вызываемых вирусами, том числе и вирусом гепатита А (HAV), не обладающими специфическим тропизмом относительно клеток иммунной системы — лимфотропностью; формирование же хронического, рецидивирующего и постоянно прогрессирующего инфекционного процесса закономерно является характерной особенностью болезней человека, вызываемых вирусами со специфическим тропизмом относительно иммунных клеток, то есть лимфотропносьтю, чему ярким примером является ВИЧ-инфекция.

Проводя аналогию между клинико-иммунологическими показателями, вариантами клинического течения, проявлениями эффекта противовирусной терапии и исходов болезни при HAV-, HBV и HCV-инфекциях нами получено. что HAV обладает преимущественно только гепатотропным свойством и лишь в единичных случаях дает хронизацию, да и то только когда вирусный гепатит развивается на фоне уже имеющихся хронической патологии печени либо вторичного иммунодефицита. Однако явных лимфотропных свойств HAV не проявляет. Отсутствие вторичного иммунодефицита вследствие прямого гепатотропного действия HAV позволяет иммунной системе реализовать адекватную противовирусную защитную реакцию, результатом чего является элиминация HAV из организма и полное выздоровление. HBV и HCV, обладая в различной степени гепатотропным действием, одновременно оказывают прямое лимфотропное, т.е. вторичный иммунодефицит формирующее воздействие.

Именно поражение иммунных клеток и развитие вторичного иммунодефицитного состояния при HBV- и HCV-инфекциях ограничивает возможности иммунной системы в реализации полноценной противовирусной реакции макроорганизма, следствием чего является формирование хронического инфекционного процесса, имеющего сходство с таковым при ВИЧ инфекции. Тождественность лимфотропных свойств HBV и HCV, а также HIV, помимо формирования вторичного иммунодефицита, подтверждается также общностью их эпидемиологических особенностей, механизмов передачи, развитием сопутствующих оппортунистических инфекций (частые ОРЗ, ОКИ) и, особенно, развитием лимфогрануломатоза в различных тканях организма. Развитие лимфогрануломатоза в различных органах и тканях организма считается присущим именно для вирусных поражений системы лимфоидных клеток (Табл. 1, Рис. 1).

Учитывая лимфотропные свойства HBV не трудно предположить, что антигены HBV (HBsAg), независимо от их титра в сыворотке, могут постоянно и существенно в больших концентрациях персистировать в цитоплазме лимфоидных элементов. Именно это явление мы использовали для повышения достоверности и исключения ложноотрицательных результатов при ИФА-анализе.

Нами с помощью ИФА-анализа проведены исследования по одновременному тестированию на наличие HBsAg в сыворотке крови и содержимом лимфоцитов больных с подозрением на вирусный гепатит. Получено, из общего числа обследованных в 17% случаях в среднем результат ИФА-анализа сыворотки крови был ложноотрицательным, так как в содержимом лимфоцитов этих же лиц были выявлены высокие титры HBsAg. Эти результаты, неопровержимо доказывают лимфотропные свойства HBV и безусловно имеют огромное практическое значение для повышения достоверности и снижения ложноотрицательных результатов при тестировании крови на наличие HBsAg с помощью ИФА-анализа.

Итак, лимфотропные свойства HBV и HCV, также как и HIV, то есть их способность проникать и реплицироваться в лимфоцитах человека, являются фактом установленным.

Исходя из изложенного выше для разработки способа обнаружения и оценки жизнеспособности HBV, HCV и HIV нами использованы лимфотропные свойства — способность этих вирусов проникать и персистировать внутриклеточно в лимфоцитах здорового человека при их совместной инкубации in vitro.

III ПРИНЦИП СПОСОБА ОБНАРУЖЕНИЯ И ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЛИМФОТРОПНЫХ ВИРУСОВ HBV, HCV И HIV.


Способ обнаружения и оценки жизнеспособности вирусов основан на использовании лимфотропных свойств – способности HBV, HCV или HIV проникать и персистировать в лимфоцитах здорового человека.

При инкубации биологического материала с взвесью лимфоцитов здорового человека, при наличии в биологическом материале HBV, HCV или HIV, вирусы проникают в цитоплазму лимфоцитов. Далее лимфоциты путем центрифугирования концентрируются в малом объеме и разрушаются путем замораживания.

Представленный метод состоит из следующих этапов: получение взвеси лимфоцитов из крови здорового человека, инкубация лимфоцитов с исследуемым биологическим материалом (плазма, сыворотка крови и др.) осаждение лимфоцитов путем центрифугирования, отмывание лимфоцитов в физиологическом растворе, осаждение лимфоцитов и растворение в малом объеме (в 500,0 мкл физиологического раствора), разрушение лимфоцитов путем замораживания, размораживание. Содержимое разрушенных лимфоцитов подвергается ИФА или ПЦР исследованию. Обнаружение в содержимом лимфоцитов вирусов методом ИФА или ПЦР свидетельствует о наличии и жизнеспособности вирусов в исследуемом биологическом материале.

IV СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЛИМФОТРОПНЫХ ВИРУСОВ HBV, HCV и HIV В ЛИМФОЦИТАХ ПАЦИЕНТОВ И ДОНОРОВ КРОВИ.


Способ позволяет обнаружить вирусы у пациентов и доноров крови даже при низких титрах вирусов в плазме или сыворотке крови.

  • 1. У обследуемого лица из локтевой осуществляется забор 5-6 мл крови вены в пробирку, содержащую 2 мл физиологического раствора и 2-3 капли гепарина.
  • 2. Из цельной гепаринизированной крови выделяются лимфоциты путем разделения в растворе фиколл-верографина с градиентом плотности d=1,077 г/мл по методу Ф.Ю. Гариб с соавт. (1995). В процессе центрифугирования все форменные элементы крови, кроме лимфоцитов, проникают через толщу градиента фиколл-верографина и находятся под ним. Плазма крови остается над градиентом. В толще градиента образуется своеобразное мутное кольцо («облако»), состоящее из чистой взвеси лимфоцитов. Это кольцо с лимфоцитами осторожно отсасывается с помощью пипетки и переносится в чистую центрифужную пробирку.
  • 3. Далее проводится двукратное промывание лимфоцитов в 10,0 мл физиологического раствора с последующим.
  • 4. После последнего центрифугирования удаляется надосадочная жидкость.
  • 5. Осадок, содержащий лимфоциты, разбавляется в 500 мкл физиологического раствора, переносится в эпиндорф и ставится в морозильную камеру бытового холодильника на 17-18 часов. При медленном замораживании мембрана лимфоцитов разрушается и содержимое цитоплазмы выходит в раствор.
  • 6. По прохождению 17-18 часов эпиндорф вынимается из морозильной камеры, оттаивается при комнатной температуре.
  • 7. Содержимое эпиндорфа подвергается ПЦР или ИФА исследованию на предмет наличия маркеров HBV, HCV или HIV.


Данный метод позволяет концентрировать вирусы из 5-6 мл плазмы или сыворотки в 500 мкл объема, повысить титр вирусных частиц выше порога чувствительности метода ИФА или ПЦР. Это способствует исключению ложноотрицательных результатов ИФА или ПЦР при тестировании доноров крови или пациентов на предмет их зараженности HBV, HCV или HIV.

V СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЛИМФОТРОПНЫХ ВИРУСОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ С СОДЕРЖАНИЕМ ОЧЕНЬ НИЗКОГО ТИТРА ВИРУСОВ.


  • Получение взвеси лимфоцитов здорового человека.
  • Здоровые люди — добровольцы методом ИФА тестируются на предмет зараженности HBV, HCV и HIV. В испытаниях как клетки-мишени используются лимфоциты здоровых людей только с отрицательными результатами тестирования.
  • Для получения достаточного количества взвеси лимфоцитов кровь забирается у здорового человека (добровольца) утром натощак из локтевой вены в количестве 30-40 мл. Далее кровь по 7-8 мл переносится в центрифужные пробирки, содержащие 2 мл физиологического раствора с 3 каплями гепарина. Смесь в пробирке тщательно перемешивается;
  • Выделение лимфоцитов из цельной гепаринизированной крови проводят путем разделения в растворе фиколл-верографина с градиентом плотности d=1,077 г/мл по методу Ф.Ю. Гариб с соавт. (1995). Для этого в чистые центрифужные пробирки наливают по 2 мл раствора фиколл-верографина, на её поверхность осторожно наслаивается гепаринизированная кровь и пробирки центрифугируются при 1500 об/мин в течение 20 мин. В процессе центрифугирования все форменные элементы крови, кроме лимфоцитов, проникают через толщу градиента фиколл-верографина и находятся под ним. Плазма крови остается над градиентом. В толще градиента образуется своеобразное мутное кольцо («облако»), состоящее из чистой взвеси лимфоцитов. Это кольцо с лимфоцитами осторожно отсасывается с помощью пипетки и переносится в чистую центрифужную пробирку;
  • Далее проводится 2х-3х кратное промывание лимфоцитов в 10,0 мл физиологического раствора с последующим центрифугированием.
  • После последнего центрифугирования удаляется надосадочная жидкость. Осадки, содержащие лимфоциты, разбавляются в 500 мкл физиологического раствора и перемешиваются. Взвесь лимфоцитов из всех пробирок сливаются в одну пробирку. Взвесь лимфоцитов можно хранить не более 1 суток при температуре + 4оС.Инкубация лимфоцитов с исследуемой биологической средой.
В 2-3 чистые пробирки наливается по 6-7 мл исследуемой биологической среды (плазма, сыворотка донорской крови или другие), которая подвергается ИФА или ПЦР тестированию на предмет зараженности HBV, HCV или HIV.
  • В каждую пробирку добавляется по 500-600 мкл взвеси лимфоцитов здорового человека, содержимое пробирок тщательно перемешивается и ставится в термостат при 370С на 6-8 часов. Каждые 0,5-1 час содержимое пробирок встряхивается и перемешивается. В процессе инкубации при наличии в исследуемой биологической среде вирусов, последние, благодаря своим лимфотропным свойствам, адгезируются на поверхности мембраны и проникают в цитоплазму лимфоцитов.
  • После инкубации пробирки вынимаются из термостата, в них добавляется по 2 мл физиологического раствора, смесь перемешивается и подвергается центрифугированию. При центрифугировании лимфоциты осаждаются на дно пробирок.
  • После центрифугирования из всех пробирок удаляется надосадочная жидкость, осадки переносятся в одну пробирку. Далее дважды проводится промывка лимфоцитов в физиологическом растворе.
  • После последнего центрифугирования из пробирки удаляется надосадочная жидкость, осадок, содержащий лимфоциты, разбавляется 600 мкл физиологического раствора и переносится в эпиндорф. Эпиндорф ставится в морозильную камеру холодильника. При медленном замораживании мембрана лимфоцитов разрушается и содержимое цитоплазмы выходит в раствор.
  • По прохождению 17-18 часов эпиндорф вынимается из морозильной камеры, оттаивается при комнатной температуре.
  • Содержимое эпиндорфа подвергается ПЦР или ИФА исследованию на предмет наличия маркеров HBV, HCV или HIV.
Данный метод позволяет концентрировать вирусы из 18-20 мл биологической среды в 500 мкл объема, повысить титр вирусных частиц выше порога чувствительности метода ИФА или ПЦР. Это способствует исключению ложноотрицательных результатов ИФА или ПЦР при тестировании биологических сред (плазма, сыворотка донорской крови и других) на предмет зараженности HBV, HCV или HIV.

VI СПОСОБ ОЦЕНКИ IN VITRO ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЛИМФОТРОПНЫХ ВИРУСОВ HBV, HCV и HIV.

  • Получение взвеси HBV, HCV или HIV. Для получения взвеси вирусов у больных зараженных моноинфекциями HBV, HCV или HIV, с заранее известной высокой вирусной нагрузкой из локтевой вены производится забор крови. Из цельной крови выделяется вируссодержащая сыворотка, которая подвергается количественному ПЦР исследованию для подтверждения наличия HBV, HCV или HIV и определения титра вирусов. Вируссодержащая сыворотка хранится в замороженном состоянии в минусовом холодильнике при температуре ниже – 25оС.
  • Получение взвеси лимфоцитов здорового человека.
  • Здоровые люди — добровольцы методом ИФА тестируются на предмет зараженности HBV, HCV и HIV. В испытаниях используются лимфоциты здоровых людей только с отрицательными результатами тестирования;
  • Для получения достаточного количества взвеси лимфоцитов кровь забирается у здорового человека (добровольца) утром натощак из локтевой вены в количестве 30-40 мл. Далее кровь по 7-8 мл переносится в центрифужные пробирки, содержащие 2 мл физиологического раствора с 3 каплями гепарина. Смесь в пробирке тщательно перемешивается;
  • Выделение лимфоцитов из цельной гепаринизированной крови проводят путем разделения в градиенте фиколл-верографин с плотностью d=1,077 г/мл по методу Ф.Ю. Гариб с соавт. (1995). Для этого в чистые центрифужные пробирки наливают по 2 мл градиента фиколл-верографина, на его поверхность осторожно наслаивается гепаринизированная кровь и пробирки центрифугируются при 1500 об/мин. В процессе центрифугирования все форменные элементы крови, кроме лимфоцитов, проникают через толщу градиента фиколл-верографина и находятся под ним. Плазма крови остается над градиентом. В толще градиента образуется своеобразное мутное кольцо («облако»), состоящее из взвеси лимфоцитов. Это кольцо с лимфоцитами осторожно отсасывается с помощью пипетки и переносится в чистую центрифужную пробирку;
  • Далее проводится 2х-3х кратное промывание лимфоцитов в 10,0 мл физиологического раствора.После последнего центрифугирования удаляется надосадочная жидкость. Осадки, содержащие лимфоциты, разбавляются в 500 мкл физиологического раствора и перемешиваются. Взвесь лимфоцитов из всех пробирок сливаются в одну пробирку. Взвесь лимфоцитов можно хранить не более 1 суток при температуре + 4оС.


Оценка in vitro способности вирусов HBV, HCV или HIV проникать в цитоплазму лимфоцитов человека.

  • HBV, HCV или HIV содержащая плазма вынимается из минусового холодильника, оттаивается при комнатной температуре.
  • В чистую пробирку с помощью автоматической пипетки переносится равный объем (по 300 мкл) вируссодержащей плазмы и взвеси лимфоцитов, содержимое перемешивается и ставится на инкубацию (инкубация вирусов с лимфоцитами in vitro) в термостат при температуре +37оС на 6-8 часов. Содержимое пробирки перемешивается путем встряхивания каждые 1,5-2 часа. При инкубации в цитоплазму лимфоцитов проникают только жизнеспособные вирусы, которые проявляют цитопатогенное действие.
  • Отмывание лимфоцитов от плазмы. Далее пробирка вынимается из термостата. В нее добавляется 6-8 мл физиологического раствора, перемешивается и центрифугируется при 1500 об./ мин. Происходит осаждение лимфоцитов на дно пробирок. Надосадочная жидкость удаляется. Далее производится 2х-3х кратное промывание в физиологическом растворе и осаждение лимфоцитов.
  • После последнего центрифугирования и удаления надосадочной жидкости взвесь лимфоцитов (осадок) разбавляется в 500 mkl физиологического раствора и переносится в эпиндорф.
  • После этого для разрушения лимфоцитов эпиндорф ставится в морозильную камеру бытового холодильника на 17-18 часов. При медленном замораживании происходит разрушение мембран лимфоцитов.
  • Надосадочная жидкость из эпиндорфа отсасывается и подвергается количественному ПЦР-исследованию на предмет выявления в содержимом цитоплазмы лимфоцитов ДНК либо РНК вирусов, которые содержались ранее в плазме крови от больных.Оценка результатов.
  • Положительный результат ПЦР-исследования на наличие РНК или ДНК вирусов в содержимом цитоплазмы лимфоцитов свидетельствует о сохранении жизнеспособности вирусов, то есть об их способности проникать и персистировать в лимфоцитах человека in vitro.
  • Отрицательный результат ПЦР исследования на наличие РНК или ДНК вирусов в содержимом цитоплазмы лимфоцитов свидетельствует об утрате жизнеспособности (инактивации) вирусов (после воздействия на них антивирусных факторов химической или физической природы), то есть об утрате их способности проникать и персистировать в лимфоцитах человека in vitro.


VII СПЕКТР ПРИМЕНЕНИЯ СПОСОБА ОБНАРУЖЕНИЯ И ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЛИМФОТРОПНЫХ ВИРУСОВ HBV, HCV и HIV.

  • Станции переливания крови: для повышения достоверности обнаружения лимфотропных вирусов гепатита В (HBV), гепатита С (HCV) и вируса иммунодефицита человека (HIV) в биологических средах (донорская кровь, плазма и другие компонеты), содержащих вирусы в концентрациях ниже порога чувствительности методов ИФА или ПЦР.
  • Диагностические лаборатории: для повышения достоверности и исключения ложноотрицательных результатов при тестировании на предмет зараженности HBV, HCV или HIV крови доноров или пациентов с содержанием вирусов в концентрациях ниже порога чувствительности методов ИФА или ПЦР.
  • Фармацевтические компании: для оценки жизнеспособности вирусов HBV, HCV или HIV после воздействия химических и физических противовирусных факторов, разрабатываемых и предлагаемых производителями в целях интактивации вирусов на различных объектах.
  • Способ позволяет исключить ошибки при диагностике у пациентов, при тестировании донорской крови и её компонентов на предмет зараженности лимфотропными вирусами HBV, HCV или HIV. Способ создаёт возможность объективно оценить эффекти химических или физических факторов на жизнеспособность (патогенность) лимфотропных вирусов.
  • Способ обнаружения и оценки жизнеспособности лимфотропных вирусов аналогов не имеет.
  • Данный способ зарегистрирован Министерством здравоохранения Республики Узбекистан

Автор: Гулямов Нариман Гулямович, доктор медицинских наук, профессор