Usul haqida

LIMFOTROP VIRUSLARNI ANIQLASH VA ULARNING YASHASH QOBILIYATINI BAHOLASH USULI

 

Limfotrop viruslarni aniqlashning ushbu usuli quyidagilar uchun mo‘ljallangan:

  • biologik muhitlarning limfotropizm xususiyatiga ega B gepatiti virusi (HBV), C gepatiti virusi (HCV) yoki odam immun tanqisligi virusi (HIV) bilan zararlanganligini haqqoniy aniqlash darajasini oshirish uchun;
  • donorlik qoni va patsientlarni HBV, HCV yoki HIV viruslari bilan zararlanganini testdan o‘tkazishda soxta salbiy reaksiyalarni istisno qilish uchun;
  • biologik materialda IFT yoki PZR metodlarining sezgirlik chegarasidan past bo‘lgan miqdordagi HBV, HCV yoki HIV viruslarini aniqlash uchun;
  • amaliy sog‘liqni saqlash sohasida viruslarni inaktivlashtirish maqsadida ishlab chiqaruvchilar tomonidan ishlab chiqiladigan va taklif qilinadigan kimyoviy va fizikaviy omillarning ta’siridan keyin viruslarning yashash qobiliyatini baholash uchun.
  • Ushbu usul analoglarga ega emas.

 

Qo‘llanish sohasi: limfotrop viruslarni aniqlash va ularning yashash qobiliyatini baholash usuli turli darajadagi diagnostika laboratoriyalarida, donorlik qoni va uning komponentlari tayyorlanadigan stantsiyalarda, kimyoviy va fizikaviy omillarning virusga qarshi samarasini nazorat qilganda qo‘llash uchun tavsiya etiladi.

 

KIRISH

B gepatiti (HBV), C gepatiti (HCV) viruslari va odam immun tanqisligi virusi – OIV (HIV) antroponoz viruslar hisoblanadi, ular faqat odam organizmidagi hujayralarni shikastlaydi va shu bois faqat odamda kasallik keltirib chiqaradi. Ushbu infeksiyalarning eksperimental modellari mavjud emas. Shuningdek ushbu viruslarning sitopatogen xususiyatlari va yashash qobiliyatini adekvat in vitro o‘rganish mumkin bo‘lgan kultivatsiyalanadigan hujayra mikroorganizmlari yo‘q.

 

B gepatiti, C gepatiti va OIV viruslarining xarakteristikalari

B gepatiti virusi (HBV) DNK saqlovchi virus hisoblanadi, uning replikatsiyasi asosan odam gepatotsitlarida yuz beradi. Shuningdek B gepatiti virusi limfotrop xususiyatlarga ega, u odam limfotsitlarini shikastlaydi va ularda replikatsiyalanadi.

C gepatiti virusi (HCV) RNK saqlovchi virus hisoblanadi, u odam gepatotsitlarida ham, limfotsitlarida ham shikastlash va ko‘payish xususiyatiga ega.

Odam immun tanqisligi virusi (HIV) qobiqli retroviruslarga kiradi va RNK saqlovchi virus hisoblanadi. CD4 limfotsitlari shikastlash va ko‘payish uchun aossiy hujayra-nishonlar hisoblanadi.

Shunday qilib,  limfotropizm, ya’ni limfoidli hujayralarga kirish va ko‘payish qobiliyati HBV, HCV va HIV viruslarining umumiy xususiyati hisoblanadi.

 

II   HBV,  HCV  VA  HIV LIMFOTROP VIRUSLARINI ANIQLASH VA ULARNING YASHASH QOBILIYATINI BAHOLASH USULINI YARATISH UCHUN SHART-SHAROITLAR

O‘zR SSV EMIK ITI surunkali infeksion jarayonni o‘rganish bo‘yicha laboratoriya xodimlari (mudir, prof. Gulyamov N.G.) tomonidan o‘tkazilgan surunkali virusli gepatitlar klinikasi, patogenezi, davolanishi va diagnostikasi masalalarini o‘rganish bo‘yicha tadqiqotlar hamda ilmiy adabiyotlarning ko‘p sonli ma’lumotlarining tahlili surunkali  HBV- va HCV- infeksiyalarda ikkilamchi immun tanqisligi jigar to‘qimalaridagi yallig‘lanish va destruktiv jarayonlarning xarakteri va ifodalanganlik darajasi bilan qonuniy korrelyatsiyaga ega emasligini aniqlash imkonini berdi. Shu bilan birga, HBV va HCV viruslari va HIV virusining mononuklear qon hujayralarida, xususan limfotsitlar va makrofaglarda persistensiyalanishi mumkinligi haqida bir-ikkita xabarlar mavjud. Biroq, ushbu faktni virusli gepatitlar patogenezi va klinikasi nuqtai nazaridan baholash ishlariga birorta tadqiqotchi tomonidan e’tibor berilmagan.

HBV- va HCV infeksiyalarda bir vaqtning o‘zida jigarda yallig‘lanish jarayonlari rivojlanishi va bunda gepatit alomatlari hamda turli darajada T-limfopeniyada va V-limfopeniyada,  T-limfotsitlar (T-xelperlar va T-supressorlar)ning regulyator subpopulyatsiyalari disproportsiyalarida, immun-regulyator indeksi (IRI)ning pasayishida va disgammaglobulinemiya hodisalarida namoyon bo‘ladigan ikkilamchi immun tanqisligi holati namoyon bo‘lishi kuzatiladi. Bunda immun tanqisligi darajasi va ifodalanganlik darajasi jigardagi patologik jarayonning namoyon bo‘lish darajasi bilan o‘zaro qonuniy aloqaga ega bo‘lmagan. Surunkali HBV- va HCV- infeksiyalariga chalingan bemorlarda vaqt o‘tishi bilan jigar to‘qimasidagi patologik jarayonning rivojlanish jadalligi kuchsizdan yaqqol namoyon bo‘lishgacha turlicha bo‘lishi mumkin, ammo bundan qat’i nazar, ikkilamchi immun tanqisligining barqaror va to‘xtovsiz chuqurlashishi yuz beradi.

 

Surunkali virusli gepatitlarning turli nozologik shakllarida jigar to‘qimasining shikastlanish darajasi va ikkilamchi immun tanqisligining chuqurligi dissotsiatsiyasi, HBV- va HCV-infeksiyalarda gepatit va ikkilamchi immun tanqisligi birgalikda kechadigan, o‘zaro bir-birini chuqurlashtiradigan jarayonlar ekanini, ammo ular o‘zaro shartlanmaganini, ya’ni HBV va HCV  gepatotroplik bilan bir qatorda yaqqol namoyon bo‘ladigan limfotroplik, ya’ni ikkilamchi immun tanqisligini shakllantirish kabi vositachilik xususiyatiga egaligini taxmin qilish uchun asos berdi. Bunda HBV- va  HCV-infeksiyalarda jigar to‘qimasi shikastlanishi va immun tanqisligi chuqurligining klinik namoyon bo‘lishlaridagi farqlar ushbu viruslarning gepatotrop va limfotrop xususiyatlarining namoyon bo‘lish darajasidagi farqlar bilan shartlanadi. Aynan viruslarning gepatotrop va limfotrop xususiyatlarining namoyon bo‘lish darajasidagi farqlar kasallikka chalinishning turli muddatlarida  surunkali HBV-  va  HCV-infeksiyalarida patogenez, klinik namoyon bo‘lishlar va virusga qarshi terapiya samarasining xarakteridagi farqlar bilan shartlanadi.

 

Odamda virusli etiologiyaga ega turli kasalliklar klinikasi va ularning qanday yakun topishi haqidagi klassik tasavvurlarni tahlil qilish quyidagi qonuniyatni aniqlash imkonini berdi:  qo‘zg‘atuvchining to‘liq eliminatsiyasi va sog‘ayib ketish bilan boradigan tsiklik kechishi viruslar, shu jumladan immun tizimi hujayralariga nisbatan o‘ziga xos tropizmga, ya’ni limfotroplikka ega bo‘lmagan  A (HAV) gepatiti virusi keltirib chiqaradigan kasalliklarga xos; surunkali, qaytalovchi va muntazam rivojlanadigan infeksion jarayonning shakllanishi esa immun tizimi hujayralariga nisbatan o‘ziga xos tropizmga, ya’ni limfotroplikka ega bo‘lgan viruslar tomonidan keltirib chiqariladigan kasalliklarning o‘ziga xos qonuniy xususiyatidir, bunga OIV-infeksiyasi yaqqol misol bo‘la oladi.

 

Klinik-immunologik ko‘rsatkichlar, klinik kechish variantlari, virusga qarshi terapiya samarasining namoyon bo‘lishi hamda HAV-, HBV  va HCV-infeksiyalarda kasalliklar qanday yakun topishi o‘rtasida o‘xshashliklarni aniqlar ekanmiz, HAV asosan faqat gepatotroplikka ega ekanini, faqat bir-ikki holatlardagina xronizatsiyani berishi, bu ham faqat virusli gepatit jigarning mavjud surunkali patologiyasi yoki ikkilamchi immun tanqisligi fonida rivojlanishini oldik.  Biroq HAV yaqqol limfotrop xususiyatlarni namoyon etmaydi. HAVning bevosita gepatotrop ta’siri oqibatida ikkilamchi immun tanqisligining yo‘qligi immun tizimiga virusga qarshi adekvat himoya reaksiyasini amalga oshirish imkonini beradi, buning natijasida HAV organizmdan eliminatsiyalanadi va bemor to‘liq sog‘ayadi. HBV  va  HCV viruslari turli darajadagi gepatotrop ta’sirga ega bo‘lgan holda, bir vaqtning o‘zida bevosita limfotrop, ya’ni ikkilamchi immun tanqisligini shakllantiruvchi ta’sir ko‘rsatadi.

 

HBV-  va  HCV-infeksiyalarda  aynan immun hujayralarining shikastlanishi va ikkilamchi immun tanqisligi holatining rivojlanishi immun tizimining makroorganizm tomonidan to‘laqonli virusga qarshi reaksiyani amalga oshirish imkoniyatini cheklaydi, buning natijasida OIV infeksiyasidagiga o‘xshash surunkali infeksion jarayon shakllanadi. HBV  va  HCV hamda HIV viruslari limfotrop xususiyatlarining o‘xshashligi ikkinlamchi immun tanqisligi shakllanishidan tashqari ularning epidemiologik xususiyatlari, yuqish mexanizmlari,  yo‘ldosh opportunistik infeksiyalar (tez-tez bo‘ladigan O‘RK, O‘II) rivojlanishi va, ayniqsa, organizmning turli to‘qimalarida limfogranulomatoz rivojlanishi umumiyligi bilan ham tasdiqlanadi. Organizmning turli a’zolarida va to‘qimalarida limfogranulomatoz rivojlanishi aynan limfoidli hujayralar tizimining virusli shikastlanishlari uchun xos hisoblanadi (1-Jadval, 1-Rasm).

 

HBV virusining limfotrop xususiyatlarini hisobga olgan holda, HBV (HBsAg) antigenlari ularning zardobdagi titridan qat’i nazar, limfoidli elementlar sitoplazmasida katta konsentratsiyalarda doimiy va jiddiy persistensiyalanishi mumkin. Biz IFT-tahlilda natijalarning haqqoniyligini oshirish va soxta salbiy natijalarni istisno qilish uchun aynan shu hodisadan foydalandik.

 

Biz IFT-tahlil yordamida virusli gepatitga gumon bor bemorlarda bir vaqtning o‘zida qon zardobida va limfotsitlar tarkibida HBsAg mavjudligiga test o‘tkazish bo‘yicha tadqiqotlar olib bordik. Ko‘rikdan o‘tkazilgan bemorlar umumiy sonining 17% da qon zardobining IFT-tahlili o‘rtacha natijasi soxta salbiy bo‘lib chiqdi, chunki ushbu shaxslarning limfotsitlari tarkibida yuqori HbsAg titrlari aniqlandi. Bu natijalar HBVning limfotrop xususiyatlarini shubhasiz isbotlaydi va qonni IFT-tahlil yordamida HbsAg bor-yo‘qligiga testdan o‘tkazganda natijalarning haqqoniyligini oshirish va soxta salbiy natijalarni kamaytirish uchun juda katta amaliy ahamiyatga ega.

Shunday qilib, HBV va HCV viruslari, shuningdek HIV virusining limfotrop xususiyatlari, ya’ni ularning odam limfotsitlariga kirish va replikatsiyalanish qobiliyati aniqlangan fakt hisoblanadi.

Yuqorida bayon etilganlardan kelib chiqqan holda, HBV, HCV va HIV viruslarini aniqlash va ularning yashash qobiliyatini baholash usulini ishlab chiqish uchun biz limfotrop xususiyatlardan, ya’ni bu viruslarning birgalikdagi in vitro inkubatsiyasida sog‘lom odam limfotsitlariga kirish va hujayra ichida persistensiyalanish qobiliyatidan foydalandik.

1-Jadval. HAV, HBV,  HCV va HIV viruslarining epidemiologik, klinik, morfologik va immunologik xususiyatlarining qiyosiy xarakteristikasi.

 

1-Rasm. HAV, HBV, HCV va  OIV viruslarining gepatotrop va limfotrop xususiyatlari

 

III   HBV,  HCV  VA  HIV LIMFOTROP VIRUSLARINI ANIQLASH VA ULARNING YASHASH QOBILIYATINI BAHOLASH USULINING TAMOYILI.

 

Viruslarni aniqlash va ularning yashash qobiliyatini baholash usuli HBV, HCV yoki HIV viruslarining limfotrop xususiyatlari, ya’ni ularning sog‘lom odam limfotsitlariga kirish va persistensiyalanish qobiliyatidan foydalanishga asoslangan.

Sog‘lom odam limfotsitlari suspenziyasiga ega biologik material inkubatsiyasida, biologik materialda HBV, HCV yoki HIV mavjud bo‘lganida, viruslar limfotsitlar sitoplazmasiga kiradi. Keyin limfotsitlar sentrifuglash yo‘li bilan kichik hajmda konsentratsiyalanadi va muzlatish yo‘li bilan nobud qilinadi.

Taqdim etilgan metod quyidagi bosqichlardan iborat: sog‘lom odam qonidan limfotsitlar suspenziyasini olish, limfotsitlarning tadqiq qilinayotgan biologik material (plazma, qon zardobi va boshq.) bilan inkubatsiyasi, limfotsitlarni sentrifuglash yo‘li bilan cho‘ktirish, limfotsitlarni fiziologik eritmada yuvish, limfotsitlarni cho‘ktirish va kichik hajmda eritish (500,0 mkl fiziologik eritmada), limfotsitlarni muzlatish yo‘li bilan parchalash, eritish. Parchalangan limfotsitlar tarkibi IFT yoki PZR tadqiqotidan o‘tkaziladi. Limfotsitlar tarkibida viruslarni IFT yoki PZR metodi bilan aniqlash tadqiq qilinadigan biologik materialda viruslar mavjudligidan va ularning yashash qobiliyatidan dalolat beradi.

 

IV   PATSIYENTLAR VA QON DONORLARINING LIMFOSITLARIDA  HBV, HCV  va HIV LIMFOTROP VIRUSLARINI ANIQLASH USULI

Ushbu usul patsientlar va qon donorlarida viruslarni ular plazma yoki qon zardobida past titrlarda bo‘lganida ham aniqlash imkonini beradi.

Ko‘rikdan o‘tkazilayotgan shaxsning tirsak venasidan 5-6 ml qon ichida 2 ml fiziologik eritma va 2-3 tomchi geparin bo‘lgan probirkaga olinadi.

Toza geparinlashtirilgan qondan F.Yu. Garib hammuallifligidagi (1995) metod bo‘yicha d=1,077 g/ml zichlik gradiyentiga ega fikoll-verografin eritmasida bo‘linish  yo‘li bilan limfotsitlar ajralib chiqadi. Sentrifuglash jarayonida qonning barcha formali elementlari, limfotsitlardan tashqari, fikoll-verografin gradiyent qalinligi orqali o‘tadi va shuning ostida turadi. Qon plazmasi gradiyent ustida qoladi. Gradiyent qalinligida limfotsitlarning toza suspenziyasidan tashkil topgan o‘ziga xos loyqa halqa (“bulut”) hosil bo‘ladi. Bu limfotsitli  halqa ehtiyotkorlik bilan pipetka yordamida so‘riladi va toza sentrifugali probirkaga o‘tkaziladi.

Keyin limfotsitlar 10,0 ml fiziologik eritmada ikki marta yuviladi.

Oxirgi marta sentrifuglashdan keyin cho‘kindi usti suyuqligi olib tashlanadi.

Tarkibida limfotsitlar bo‘lgan cho‘kindi 500 mkl fiziologik eritmada suyultiriladi, epindorfga o‘tkaziladi va maishiy sovutgichning muzlatish kamerasiga 17-18 soatga qo‘yiladi. Sekin muzlatilganda limfotsitlar membranasi parchalanadi va sitoplazma tarkibi eritmaga chiqadi.

17-18 soat o‘tganidan keyin epindorf muzlatish kamerasidan olinadi, xona haroratida eritiladi.

Epindorf tarkibi HBV, HCV yoki HIV markerlari bor-yo‘qligiga PZR yoki IFT tadqiqotdan o‘tkaziladi.

Ushbu metod viruslarni 5-6 ml plazma yoki 500 mkl zardobdan konsentratsiyalash, IFT yoki PZR metodining sezgirlik chegarasidan yuqori bo‘lgan virus zarralarining titrini oshirish imkonini beradi. Bu qon donorlari va patsientlarni HBV, HCV yoki HIV ga zararlanganlik bo‘yicha testdan o‘tkazganda IFT yoki PZRda soxta salbiy natijalarni istisno qilishga ko‘maklashadi.

 

V   TARKIBIDA VIRUSLAR TITRI JUDA PAST BO‘LGAN BIOLOGIK MUHITLARDA LIMFOTROP VIRUSLARNI ANIQLASH USULI.

Sog‘lom odam limfotsitlari suspenziyasini olish.

Sog‘lom odamlar – ko‘ngillilar IFT metodi yordamida HBV, HCV yoki HIV viruslarini yuqtirganlik bo‘yicha testdan o‘tkaziladi. Sinovlarda nishon hujayralar sifatida faqat salbiy test natijalariga ega sog‘lom odamlarning limfotsitlaridan foydalaniladi.

Limfotsitlarning yetarli miqdorda suspenziyasini olish uchun sog‘lom odam (ko‘ngilli)ning qoni ertalab och qoringa tirsak venasidan 30-40 ml miqdorda olinadi. Keyin qon 7-8 ml dan tarkibida 2 ml fiziologik eritma va 3 tomchi geparin bo‘lgan sentrifuga probirkalariga solinadi.  Probirkadagi aralashma yaxshilab aralashtiriladi;

Toza geparinlashtirilgan qondan limfotsitlarni ajratish F.Yu. Garib hammuallifligidagi (1995) metod bo‘yicha d=1,077 g/ml zichlik gradiyentiga ega fikoll-verografin eritmasida bo‘linish  yo‘li bilan amalga oshiriladi. Buning uchun toza sentrifugali probirkalarga 2 ml dan fikoll-verografin eritmasi quyiladi, uning yuzasiga ehtiyotlik bilan geparinlashtirilgan qon solinadi va probirkalar 20 daqiqa davomida 1500 aylanma/daq.da sentrifuglanadi. Sentrifuglash jarayonida barcha qonning forma elementlari, limfotsitlardan tashqari, fikoll-verografin gradiyent qalinligi orqali o‘tadi va shuning ostida turadi. Qon plazmasi gradiyent ustida qoladi. Gradiyent qalinligida limfotsitlarning toza suspenziyasidan tashkil topgan o‘ziga xos loyqa halqa (“bulut”) hosil bo‘ladi. Bu limfotsitli  halqa ehtiyotkorlik bilan pipetka yordamida so‘riladi va toza sentrifugali probirkaga o‘tkaziladi;

Keyin limfotsitlar 10,0 ml fiziologik eritmada ikki-uch marta yuviladi va sentrifuglanadi.

Oxirgi marta sentrifuglashdan keyin cho‘kindi usti suyuqligi olib tashlanadi. Tarkibida limfotsitlar bo‘lgan cho‘kindi 500 mkl fiziologik eritmada suyultiriladi va aralashtiriladi. Barcha probirkalardagi limfotsitlar suspenziyasi bitta probirkaga quyiladi. Limfotsitlar suspenziyasini + 4oC haroratda 1 sutkadan ortiq saqlash mumkin emas. Limfotsitlarning tadqiq qilinayotgan biologik muhit bilan inkubatsiyasi.

2-3 ta toza probirkaga 6-7 ml dan tadqiq qilinayotgan biologik muhit (plazma, donorlik qoni zardobi yoki boshqalar) quyiladi, u HBV, HCV yoki HIV bilan zararlanganlik bo‘yicha IFT yoki PZR testdan o‘tkaziladi.

Har bir probirkaga 500-600 mkl dan sog‘lom odam limfotsitlari suspenziyasi qo‘shiladi, probirkalar tarkibi yaxshilab aralashtiriladi va 370C da 6-8 soatga termostatga qo‘yiladi. Har 0,5-1 soatda probirkalar tarkibi chayqatiladi va aralashtiriladi. Inkubatsiya jarayonida tadqiq qilinayotgan biologik muhitda viruslar mavjud bo‘lganida, ular o‘zining limfotrop xususiyatlari tufayli  membrana yuzasida adgeziyalanadi va limfotsitlar sitoplazmasiga o‘tadi.

Inkubatsiyadan keyin probirkalar termostatdan olinadi, ularga 2 ml dan fiziologik eritma qo‘shiladi, aralashma aralashtiriladi va sentrifuglanadi. Sentrifuglanganda limfotsitlar probirkalar tubiga cho‘kadi.

Sentrifuglashdan keyin barcha probirkalardan cho‘kindi usti suyuqligi olib tashlanadi, cho‘kindilar bitta probirkaga o‘tkaziladi. Keyin limfotsitlar ikki marta fiziologik eritmada yuviladi.

Oxirgi sentrifuglashdan keyin probirkadan cho‘kindi usti suyuqligi olib tashlanadi, tarbikida limfotsitlar bo‘lgan cho‘kindi 600 mkl fiziologik eritma bilan suyultiriladi va epindorfga o‘tkaziladi. Epindorf sovutgichning muzlatish kamerasiga qo‘yiladi. Sekin muzlatilganda limfotsitlar membranasi parchalanadi va sitoplazma tarkibi eritmaga chiqadi.

17-18 soat o‘tganidan keyin epindorf muzlatish kamerasidan olinadi, xona haroratida eritiladi.

Epindorf tarkibi HBV, HCV yoki HIV markerlari bor-yo‘qligiga PZR yoki IFT tadqiqotdan o‘tkaziladi.

Ushbu metod viruslarni18-20 ml biologik muhitdan 500 mkl hajmda konsentratsiyalash, IFT yoki PZR metodining sezgirlik chegarasidan yuqori bo‘lgan virus zarralarining titrini oshirish imkonini beradi. Biologik muhitlarni (plazma, donorlik qoni zardobi va boshqalar) HBV, HCV yoki HIV ga zararlanganlik bo‘yicha testdan o‘tkazganda IFT yoki PZRda soxta salbiy natijalarni istisno qilishga ko‘maklashadi.

 

VI   HBV, HCV va HIV LIMFOTROP VIRUSLARNING YASHASH QOBILIYATINI IN  VITRO  BAHOLASH USULI

HBV, HCV yoki HIV suspenziyasini olish.

Oldindan ma’lum yuqori virusli yuklamaga ega HBV, HCV yoki HIV monoinfeksiyalarini yuqtirgan bemorlarda viruslar suspenziyasini olish uchun tirsak venasidan qon olinadi. Toza qondan virus saqlovchi zardob ajratiladi, u HBV, HCV yoki HIV mavjudligini tasdiqlash va viruslar titrlarini aniqlash uchun miqdoriy PZR tadqiqotidan o‘tkaziladi. Virus saqlovchi zardob muzlatilgan holatda minusli sovutgichda – 25oC dan past haroratda saqlanadi.

Sog‘lom odamdan limfotsitlar suspenziyasini olish.

Sog‘lom odamlar – ko‘ngillilar IFT metodi yordamida HBV, HCV va HIV ni yuqtirganlik bo‘yicha testdan o‘tkaziladi. Sinovlarda faqat salbiy test natijalariga ega sog‘lom odamlarning limfotsitlaridan foydalaniladi;

Limfotsitlarning yetarli miqdorda suspenziyasini olish uchun sog‘lom odam (ko‘ngilli)ning qoni ertalab och qoringa tirsak venasidan 30-40 ml miqdorda olinadi. Keyin qon 7-8 ml dan tarkibida 2 ml fiziologik eritma va 3 tomchi geparin bo‘lgan sentrifuga probirkalariga solinadi.  Probirkadagi aralashma yaxshilab aralashtiriladi;

Toza geparinlashtirilgan qondan limfotsitlarni ajratish F.Yu. Garib hammuallifligidagi (1995) metod bo‘yicha d=1,077 g/ml zichlik gradiyentiga ega fikoll-verografin eritmasida bo‘linish  yo‘li bilan amalga oshiriladi. Buning uchun toza sentrifugali probirkalarga 2 ml dan fikoll-verografin eritmasi quyiladi, uning yuzasiga ehtiyotlik bilan geparinlashtirilgan qon solinadi va probirkalar 20 daqiqa davomida 1500 aylanma/daq.da sentrifuglanadi. Sentrifuglash jarayonida qonning barcha forma elementlari, limfotsitlardan tashqari, fikoll-verografin gradiyent qalinligi orqali o‘tadi va shuning ostida turadi. Qon plazmasi gradiyent ustida qoladi. Gradiyent qalinligida limfotsitlarning toza suspenziyasidan tashkil topgan o‘ziga xos loyqa halqa (“bulut”) hosil bo‘ladi. Bu limfotsitli  halqa ehtiyotkorlik bilan pipetka yordamida so‘riladi va toza sentrifugali probirkaga o‘tkaziladi;

Keyin limfotsitlar 10,0 ml fiziologik eritmada ikki-uch marta yuviladi. Tarkibida limfotsitlar bo‘lgan cho‘kindilar 500 mkl fiziologik eritmada suyultiriladi va aralashtiriladi. Barcha probirkalardagi limfotsitlar suspenziyasi bitta probirkaga quyiladi. Limfotsitlar suspenziyasini + 4oC haroratda 1 sutkadan ortiq saqlash mumkin emas. HBV, HCV yoki HIV viruslarining odam limfotsitlari sitoplazmasiga o‘tish qobiliyatini in vitro baholash.

HBV, HCV yoki HIV saqlovchi plazma minusli sovutgichdan chiqarib olinadi, xona haroratida eritiladi.

Toza probirkaga avtomat pipetka yordamida teng hajmda (300 mkl dan) virus saqlovchi plazma va limfotsitlar suspenziyasi o‘tkaziladi, aralashtiriladi va +37oC haroratda 6-8 soatga termostatga inkubatsiyaga (viruslarning limfotsitlar bilan in vitro inkubatsiyasi) qo‘yiladi. Probirka tarkibi har 1,5-2 soatda chayqatish yo‘li bilan aralashtiriladi. Inkubatsiya paytida limfotsitlar sitoplazmasiga faqat yashash qobiliyatiga ega viruslar kiradi, ular sitopatogen ta’sirni namoyon qiladi.

Limfotsitlarni plazmadan yuvib tashlash. Keyin probirka termostatdan chiqarib olinadi. Unga 6-8 ml fiziologik eritma qo‘shiladi, aralashtiriladi va 1500 aylanma/daq.da sentrifuglanadi. Bunda limfotsitlarning probirkalar tubiga cho‘kishi yuz beradi. Cho‘kma usti suyuqligi olib tashlanadi. Keyin fiziologik eritmada 2-3 marta yuviladi va  limfotsitlar cho‘ktiriladi.

Oxirgi sentrifuglashdan keyin va cho‘kindi usti suyuqligi olib tashlanganidan so‘ng limfotsitlar suspenziyasiga (cho‘kindi) 500 mkl fiziologik eritma qo‘shiladi va epindorfga o‘tkaziladi.

Shundan so‘ng limfotsitlarni parchalash uchun epindorf maishiy sovutgichning muzlatish kamerasiga 17-18 soatga qo‘yiladi. Sekin muzlatganda limfotsitlar membranasining parchalanishi yuz beradi.

Epindorfdagi cho‘kindi usti suyuqligi so‘rib olinadi va limfotsitlar sitoplazmasi tarkibida oldin bemorlar qon plazmasida mavjud bo‘lgan viruslarning DNK yoki RNKsi bor-yo‘qligini aniqlash uchun miqdoriy PZR tadqiqoti o‘tkaziladi. Natijalarni baholash.

Limfotsitlar sitoplazmasida viruslar RNK yoki DNKsi bor-yo‘qligi bo‘yicha o‘tkazilgan PZR tadqiqotning ijobiy natijasi viruslarning yashash qobiliyati, ya’ni in vitro odam lifotsitlariga kirish va u yerda persistensiyalanish qobiliyati saqlanib qolganidan dalolat beradi.

Bu boradagi PZR tadqiqotning salbiy natijasi esa viruslarning (ularga viruslarga qarshi kimyoviy yoki fizikaviy omillar bilan ta’sir ko‘rsatgandan keyin ) yashash qobiliyati (inaktivlashtirish), ya’ni in vitro odam lifotsitlariga kirish va u yerda persistensiyalanish qobiliyati yo‘qolganidan dalolat beradi.

 

VII   HBV, HCV  va  HIV VIRUSLARNI ANIQLASH VA ULARNING YASHASH QOBILIYATINI BAHOLASH USULINING QO‘LLANISH DOIRASI

Qon quyish stantsiyalari: B gepatiti (HBV), C gepatiti (HCV) viruslari va odam immun tanqisligi virusi (HIV)ni IFT yoki PZR metodlarining sezgirlik chegarasidan past konsentratsiyalardagi viruslarni saqlovchi biologik muhitlarda (donorlik qoni, plazma va boshqa komponentlar) aniqlashning haqqoniylik darajasini oshirish uchun.

Diagnostika laboratoriyalari: viruslar konsentratsiyasi IFT yoki PZR metodlarining sezgirlik chegarasidan past bo‘lgan donorlar yoki patsientlar qonida HBV, HCV yoki HIV viruslari bor-yo‘qligini testdan o‘tkazishda natijalarning haqqoniyligini oshirish va soxta salbiy natijalarning istisno qilish uchun.

Farmatsevtika kompaniyalari: ishlab chiqaruvchilar tomonidan turli obyektlarda viruslarni inaktivlashtirish maqsadlarida ishlab chiqiladigan va taklif qilinadigan viruslarga qarshi kimyoviy va fizikaviy omillar ta’siridan keyin HBV, HCV  yoki HIV viruslarining yashash qobiliyatini baholash uchun.

Ushbu usulpatsientlar diagnostikasida, donorlik qoni va uning komponentlari HBV, HCV  yoki HIV limfotrop viruslar bilan zararlanganini tekshirganda xatoliklarni istisno qilish imkonini beradi. U kimyoviy yoki fizikaviy omillarning limfotrop viruslar yashash qobiliyatiga (patogenlik) samarasini xolis baholash imkonini yaratadi.

Limfotrop viruslarni aniqlash va ularning yashash qobiliyatini baholash usuli analoglarga ega emas.

Ushbu usul O‘zbekiston Resmpublikasi Sog‘liqni saqlash vazirligi tomonidan ro‘yxatga olingan

Muallif: Gulyamov  Nariman  Gulyamovich, tibbiyot fanlari doktori, professor