Усул ҳақида

ЛИМФОТРОП ВИРУСЛАРНИ АНИҚЛАШ ВА УЛАРНИНГ ЯШАШ ҚОБИЛИЯТИНИ БАҲОЛАШ УСУЛИ

 

Лимфотроп вирусларни аниқлашнинг ушбу усули қуйидагилар учун мўлжалланган:

 

  • биологик муҳитларнинг лимфотропизм хусусиятига эга В гепатити вируси (HBV), С гепатити вируси (HCV) ёки одам иммун танқислиги вируси (HIV) билан зарарланганлигини ҳаққоний аниқлаш даражасини ошириш учун;
  • донорлик қони ва пациентларни HBV, HCV ёки HIV вируслари билан зарарланганини тестдан ўтказишда сохта салбий реакцияларни истисно қилиш учун;
  • биологик материалда ИФТ ёки ПЗР методларининг сезгирлик чегарасидан паст бўлган миқдордаги HBV, HCV ёки HIV вирусларини аниқлаш учун;
  • амалий соғлиқни сақлаш соҳасида вирусларни инактивлаштириш мақсадида ишлаб чиқарувчилар томонидан ишлаб чиқиладиган ва таклиф қилинадиган кимёвий ва физикавий омилларнинг таъсиридан кейин вирусларнинг яшаш қобилиятини баҳолаш учун.

Ушбу усул аналогларга эга эмас.

Қўлланиш соҳаси: лимфотроп вирусларни аниқлаш ва уларнинг яшаш қобилиятини баҳолаш усули турли даражадаги диагностика лабораторияларида, донорлик қони ва унинг компонентлари тайёрланадиган станцияларда, кимёвий ва физикавий омилларнинг вирусга қарши самарасини назорат қилганда қўллаш учун тавсия этилади.

 

КИРИШ

В гепатити (HBV), С гепатити (HCV) вируслари ва одам иммун танқислиги вируси – ОИВ (HIV) антропоноз вируслар ҳисобланади, улар фақат одам организмидаги ҳужайраларни шикастлайди ва шу боис фақат одамда касаллик келтириб чиқаради. Ушбу инфекцияларнинг экспериментал моделлари мавжуд эмас. Шунингдек ушбу вирусларнинг цитопатоген хусусиятлари ва яшаш қобилиятини адекват in vitro ўрганиш мумкин бўлган культивацияланадиган ҳужайра микроорганизмлари йўқ.

 

В гепатити, С гепатити ва ОИВ вирусларининг характеристикалари.

В гепатити вируси (HBV) ДНК сақловчи вирус ҳисобланади, унинг репликацияси асосан одам гепатоцитларида юз беради. Шунингдек B гепатити вируси лимфотроп хусусиятларга эга, у одам лимфоцитларини шикастлайди ва уларда репликацияланади.

С гепатити вируси (HCV) РНК сақловчи вирус ҳисобланади, у одам гепатоцитларида ҳам, лимфоцитларида ҳам шикастлаш ва кўпайиш хусусиятига эга.

Одам иммун танқислиги вируси (HIV) қобиқли ретровирусларга киради ва РНК сақловчи вирус ҳисобланади. CD4 лимфоцитлари шикастлаш ва кўпайиш учун аоссий ҳужайра-нишонлар ҳисобланади.

Шундай қилиб,  лимфотропизм, яъни лимфоидли ҳужайраларга кириш ва кўпайиш қобилияти HBV, HCV ва HIV вирусларининг умумий хусусияти ҳисобланади.

 

II   HBV,  HCV  ВА  HIV ЛИМФОТРОП ВИРУСЛАРИНИ АНИҚЛАШ ВА УЛАРНИНГ ЯШАШ ҚОБИЛИЯТИНИ БАҲОЛАШ УСУЛИНИ ЯРАТИШ УЧУН ШАРТ-ШАРОИТЛАР

ЎзР ССВ ЭМИК ИТИ сурункали инфекцион жараённи ўрганиш бўйича лаборатория ходимлари (мудир, проф. Гулямов Н.Г.) томонидан ўтказилган сурункали вирусли гепатитлар клиникаси, патогенези, даволаниши ва диагностикаси масалаларини ўрганиш бўйича тадқиқотлар ҳамда илмий адабиётларнинг кўп сонли маълумотларининг таҳлили сурункали  HBV- ва HCV- инфекцияларда иккиламчи иммун танқислиги жигар тўқималаридаги яллиғланиш ва деструктив жараёнларнинг характери ва ифодаланганлик даражаси билан қонуний корреляцияга эга эмаслигини аниқлаш имконини берди. Шу билан бирга, HBV ва HCV вируслари ва HIV вирусининг мононуклеар қон ҳужайраларида, хусусан лимфоцитлар ва макрофагларда персистенцияланиши мумкинлиги ҳақида бир-иккита хабарлар мавжуд. Бироқ, ушбу фактни вирусли гепатитлар патогенези ва клиникаси нуқтаи назаридан баҳолаш ишларига бирорта тадқиқотчи томонидан эътибор берилмаган.

HBV- ва HCV инфекцияларда бир вақтнинг ўзида жигарда яллиғланиш жараёнлари ривожланиши ва бунда гепатит аломатлари ҳамда турли даражада Т-лимфопенияда ва В-лимфопенияда,  Т-лимфоцитлар (Т-хелперлар ва Т-супрессорлар)нинг регулятор субпопуляциялари диспропорцияларида, иммун-регулятор индекси (ИРИ)нинг пасайишида ва дисгаммаглобулинемия ҳодисаларида намоён бўладиган иккиламчи иммун танқислиги ҳолати намоён бўлиши кузатилади. Бунда иммун танқислиги даражаси ва ифодаланганлик даражаси жигардаги патологик жараённинг намоён бўлиш даражаси билан ўзаро қонуний алоқага эга бўлмаган. Сурункали HBV- ва HCV- инфекцияларига чалинган беморларда вақт ўтиши билан жигар тўқимасидаги патологик жараённинг ривожланиш жадаллиги кучсиздан яққол намоён бўлишгача турлича бўлиши мумкин, аммо бундан қатъи назар, иккиламчи иммун танқислигининг барқарор ва тўхтовсиз чуқурлашиши юз беради.

 

Сурункали вирусли гепатитларнинг турли нозологик шаклларида жигар тўқимасининг шикастланиш даражаси ва иккиламчи иммун танқислигининг чуқурлиги диссоциацияси, HBV- ва HCV-инфекцияларда гепатит ва иккиламчи иммун танқислиги биргаликда кечадиган, ўзаро бир-бирини чуқурлаштирадиган жараёнлар эканини, аммо улар ўзаро шартланмаганини, яъни HBV ва HCV  гепатотроплик билан бир қаторда яққол намоён бўладиган лимфотроплик, яъни иккиламчи иммун танқислигини шакллантириш каби воситачилик хусусиятига эгалигини тахмин қилиш учун асос берди. Бунда HBV- ва  HCV-инфекцияларда жигар тўқимаси шикастланиши ва иммун танқислиги чуқурлигининг клиник намоён бўлишларидаги фарқлар ушбу вирусларнинг гепатотроп ва лимфотроп хусусиятларининг намоён бўлиш даражасидаги фарқлар билан шартланади. Айнан вирусларнинг гепатотроп ва лимфотроп хусусиятларининг намоён бўлиш даражасидаги фарқлар касалликка чалинишнинг турли муддатларида  сурункали HBV-  ва  HCV-инфекцияларида патогенез, клиник намоён бўлишлар ва вирусга қарши терапия самарасининг характеридаги фарқлар билан шартланади.

 

Одамда вирусли этиологияга эга турли касалликлар клиникаси ва уларнинг қандай якун топиши ҳақидаги классик тасаввурларни таҳлил қилиш қуйидаги қонуниятни аниқлаш имконини берди:  қўзғатувчининг тўлиқ элиминацияси ва соғайиб кетиш билан борадиган циклик кечиши вируслар, шу жумладан иммун тизими ҳужайраларига нисбатан ўзига хос тропизмга, яъни лимфотропликка эга бўлмаган  А (HAV) гепатити вируси келтириб чиқарадиган касалликларга хос; сурункали, қайталовчи ва мунтазам ривожланадиган инфекцион жараённинг шаклланиши эса иммун тизими ҳужайраларига нисбатан ўзига хос тропизмга, яъни лимфотропликка эга бўлган вируслар томонидан келтириб чиқариладиган касалликларнинг ўзига хос қонуний хусусиятидир, бунга ОИВ-инфекцияси яққол мисол бўла олади.

 

Клиник-иммунологик кўрсаткичлар, клиник кечиш вариантлари, вирусга қарши терапия самарасининг намоён бўлиши ҳамда HAV-, HBV  ва HCV-инфекцияларда касалликлар қандай якун топиши ўртасида ўхшашликларни аниқлар эканмиз, HAV асосан фақат гепатотропликка эга эканини, фақат бир-икки ҳолатлардагина хронизацияни бериши, бу ҳам фақат вирусли гепатит жигарнинг мавжуд сурункали патологияси ёки иккиламчи иммун танқислиги фонида ривожланишини олдик.  Бироқ HAV яққол лимфотроп хусусиятларни намоён этмайди. HAVнинг бевосита гепатотроп таъсири оқибатида иккиламчи иммун танқислигининг йўқлиги иммун тизимига вирусга қарши адекват ҳимоя реакциясини амалга ошириш имконини беради, бунинг натижасида HAV организмдан элиминацияланади ва бемор тўлиқ соғаяди. HBV  ва  HCV вируслари турли даражадаги гепатотроп таъсирга эга бўлган ҳолда, бир вақтнинг ўзида бевосита лимфотроп, яъни иккиламчи иммун танқислигини шакллантирувчи таъсир кўрсатади.

 

HBV-  ва  HCV-инфекцияларда  айнан иммун ҳужайраларининг шикастланиши ва иккиламчи иммун танқислиги ҳолатининг ривожланиши иммун тизимининг макроорганизм томонидан тўлақонли вирусга қарши реакцияни амалга ошириш имкониятини чеклайди, бунинг натижасида ОИВ инфекциясидагига ўхшаш сурункали инфекцияон жараён шаклланади. HBV  ва  HCV ҳамда HIV вируслари лимфотроп хусусиятларининг ўхшашлиги иккинламчи иммун танқислиги шаклланишидан ташқари уларнинг эпидемиологик хусусиятлари, юқиш механизмлари,  йўлдош оппортунистик инфекциялар (тез-тез бўладиган ЎРК, ЎИИ) ривожланиши ва, айниқса, организмнинг турли тўқималарида лимфогрануломатоз ривожланиши умумийлиги билан ҳам тасдиқланади. Организмнинг турли аъзоларида ва тўқималарида лимфогрануломатоз ривожланиши айнан лимфоидли ҳужайралар тизимининг вирусли шикастланишлари учун хос ҳисобланади (1-Жадвал, 1-Расм).

 

HBV вирусининг лимфотроп хусусиятларини ҳисобга олган ҳолда, HBV (HBsAg) антигенлари уларнинг зардобдаги титридан қатъи назар, лимфоидли элементлар цитоплазмасида катта концентрацияларда доимий ва жиддий персистенцияланиши мумкин. Биз ИФТ-таҳлилда натижаларнинг ҳаққонийлигини ошириш ва сохта салбий натижаларни истисно қилиш учун айнан шу ҳодисадан фойдаландик.

 

Биз ИФТ-таҳлил ёрдамида вирусли гепатитга гумон бор беморларда бир вақтнинг ўзида қон зардобида ва лимфоцитлар таркибида HBsAg мавжудлигига тест ўтказиш бўйича тадқиқотлар олиб бордик. Кўрикдан ўтказилган беморлар умумий сонининг 17% да қон зардобининг ИФТ-таҳлили ўртача натижаси сохта салбий бўлиб чиқди, чунки ушбу шахсларнинг лимфоцитлари таркибида юқори HbsAg титрлари аниқланди. Бу натижалар HBVнинг лимфотроп хусусиятларини шубҳасиз исботлайди ва қонни ИФТ-таҳлил ёрдамида HbsAg бор-йўқлигига тестдан ўтказганда натижаларнинг ҳаққонийлигини ошириш ва сохта салбий натижаларни камайтириш учун жуда катта амалий аҳамиятга эга.

Шундай қилиб, HBV ва HCV вируслари, шунингдек HIV вирусининг лимфотроп хусусиятлари, яъни уларнинг одам лимфоцитларига кириш ва репликацияланиш қобилияти аниқланган факт ҳисобланади.

 

Юқорида баён этилганлардан келиб чиққан ҳолда, HBV, HCV ва HIV вирусларини аниқлаш ва уларнинг яшаш қобилиятини баҳолаш усулини ишлаб чиқиш учун биз лимфотроп хусусиятлардан, яъни бу вирусларнинг биргаликдаги in vitro инкубациясида соғлом одам лимфоцитларига кириш ва ҳужайра ичида персистенцияланиш қобилиятидан фойдаландик.

1-Жадвал. HAV, HBV,  HCV ва HIV вирусларининг эпидемиологик, клиник, морфологик ва иммунологик хусусиятларининг қиёсий характеристикаси.

 

1-Расм. HAV, HBV, HCV ва  ОИВ вирусларининг гепатотроп ва лимфотроп хусусиятлари

 

III   HBV,  HCV  ВА  HIV ЛИМФОТРОП ВИРУСЛАРИНИ АНИҚЛАШ ВА УЛАРНИНГ ЯШАШ ҚОБИЛИЯТИНИ БАҲОЛАШ УСУЛИНИНГ ТАМОЙИЛИ.

Вирусларни аниқлаш ва уларнинг яшаш қобилиятини баҳолаш усули HBV, HCV ёки HIV вирусларининг лимфотроп хусусиятлари, яъни уларнинг соғлом одам лимфоцитларига кириш ва персистенцияланиш қобилиятидан фойдаланишга асосланган.

Соғлом одам лимфоцитлари суспензиясига эга биологик материал инкубациясида, биологик материалда HBV, HCV ёки HIV мавжуд бўлганида, вируслар лимфоцитлар цитоплазмасига киради. Кейин лимфоцитлар центрифуглаш йўли билан кичик ҳажмда концентрацияланади ва музлатиш йўли билан нобуд қилинади.

Тақдим этилган метод қуйидаги босқичлардан иборат: соғлом одам қонидан лимфоцитлар суспензиясини олиш, лимфоцитларнинг тадқиқ қилинаётган биологик материал (плазма, қон зардоби ва бошқ.) билан инкубацияси, лимфоцитларни центрифуглаш йўли билан чўктириш, лимфоцитларни физиологик эритмада ювиш, лимфоцитларни чўктириш ва кичик ҳажмда эритиш (500,0 мкл физиологик эритмада), лимфоцитларни музлатиш йўли билан парчалаш, эритиш. Парчаланган лимфоцитлар таркиби ИФТ ёки ПЗР тадқиқотидан ўтказилади. Лимфоцитлар таркибида вирусларни ИФТ ёки ПЗР методи билан аниқлаш тадқиқ қилинадиган биологик материалда вируслар мавжудлигидан ва уларнинг яшаш қобилиятидан далолат беради.

 

IV   ПАЦИЕНТЛАР ВА ҚОН ДОНОРЛАРИНИНГ ЛИМФОЦИТЛАРИДА  HBV, HCV  ва HIV ЛИМФОТРОП ВИРУСЛАРИНИ АНИҚЛАШ УСУЛИ

Ушбу усул пациентлар ва қон донорларида вирусларни улар плазма ёки қон зардобида паст титрларда бўлганида ҳам аниқлаш имконини беради.

Кўрикдан ўтказилаётган шахснинг тирсак венасидан 5-6 мл қон ичида 2 мл физиологик эритма ва 2-3 томчи гепарин бўлган пробиркага олинади.

Тоза гепаринлаштирилган қондан Ф.Ю. Гариб ҳаммуаллифлигидаги (1995) метод бўйича d=1,077 г/мл зичлик градиентига эга фиколл-верографин эритмасида бўлиниш  йўли билан лимфоцитлар ажралиб чиқади. Центрифуглаш жараёнида қоннинг барча формали элементлари, лимфоцитлардан ташқари, фиколл-верографин градиент қалинлиги орқали ўтади ва шунинг остида туради. Қон плазмаси градиент устида қолади. Градиент қалинлигида лимфоцитларнинг тоза суспензиясидан ташкил топган ўзига хос лойқа ҳалқа (“булут”) ҳосил бўлади. Бу лимфоцитли  ҳалқа эҳтиёткорлик билан пипетка ёрдамида сўрилади ва тоза центрифугали пробиркага ўтказилади.

Кейин лимфоцитлар 10,0 мл физиологик эритмада икки марта ювилади.

Охирги марта центрифуглашдан кейин чўкинди усти суюқлиги олиб ташланади.

Таркибида лимфоцитлар бўлган чўкинди 500 мкл физиологик эритмада суюлтирилади, эпиндорфга ўтказилади ва маиший совутгичнинг музлатиш камерасига 17-18 соатга қўйилади. Секин музлатилганда лимфоцитлар мембранаси парчаланади ва цитоплазма таркиби эритмага чиқади.

17-18 соат ўтганидан кейин эпиндорф музлатиш камерасидан олинади, хона ҳароратида эритилади.

Эпиндорф таркиби HBV, HCV ёки HIV маркерлари бор-йўқлигига ПЗР ёки ИФТ тадқиқотдан ўтказилади.

Ушбу метод вирусларни 5-6 мл плазма ёки 500 мкл зардобдан концентрациялаш, ИФТ ёки ПЗР методининг сезгирлик чегарасидан юқори бўлган вирус зарраларининг титрини ошириш имконини беради. Бу қон донорлари ва пациентларни HBV, HCV ёки HIV га зарарланганлик бўйича тестдан ўтказганда ИФТ ёки ПЗРда сохта салбий натижаларни истисно қилишга кўмаклашади.

 

V   ТАРКИБИДА ВИРУСЛАР ТИТРИ ЖУДА ПАСТ БЎЛГАН БИОЛОГИК МУҲИТЛАРДА ЛИМФОТРОП ВИРУСЛАРНИ АНИҚЛАШ УСУЛИ.

Соғлом одам лимфоцитлари суспензиясини олиш.

Соғлом одамлар – кўнгиллилар ИФТ методи ёрдамида HBV, HCV ёки HIV вирусларини юқтирганлик бўйича тестдан ўтказилади. Синовларда нишон ҳужайралар сИФТтида фақат салбий тест натижаларига эга соғлом одамларнинг лимфоцитларидан фойдаланилади.

Лимфоцитларнинг етарли миқдорда суспензиясини олиш учун соғлом одам (кўнгилли)нинг қони эрталаб оч қоринга тирсак венасидан 30-40 мл миқдорда олинади. Кейин қон 7-8 мл дан таркибида 2 мл физиологик эритма ва 3 томчи гепарин бўлган центрифуга пробиркаларига солинади.  Пробиркадаги аралашма яхшилаб аралаштирилади;

Тоза гепаринлаштирилган қондан лимфоцитларни ажратиш Ф.Ю. Гариб ҳаммуаллифлигидаги (1995) метод бўйича d=1,077 г/мл зичлик градиентига эга фиколл-верографин эритмасида бўлиниш  йўли билан амалга оширилади. Бунинг учун тоза центрифугали пробиркаларга 2 мл дан фиколл-верографин эритмаси қуйилади, унинг юзасига эҳтиётлик билан гепаринлаштирилган қон солинади ва пробиркалар 20 дақиқа давомида 1500 айланма/дақ.да центрифугланади. Центрифуглаш жараёнида барча қоннинг форма элементлари, лимфоцитлардан ташқари, фиколл-верографин градиент қалинлиги орқали ўтади ва шунинг остида туради. Қон плазмаси градиент устида қолади. Градиент қалинлигида лимфоцитларнинг тоза суспензиясидан ташкил топган ўзига хос лойқа ҳалқа (“булут”) ҳосил бўлади. Бу лимфоцитли  ҳалқа эҳтиёткорлик билан пипетка ёрдамида сўрилади ва тоза центрифугали пробиркага ўтказилади;

Кейин лимфоцитлар 10,0 мл физиологик эритмада икки-уч марта ювилади ва центрифугланади.

Охирги марта центрифуглашдан кейин чўкинди усти суюқлиги олиб ташланади. Таркибида лимфоцитлар бўлган чўкинди 500 мкл физиологик эритмада суюлтирилади ва аралаштирилади. Барча пробиркалардаги лимфоцитлар суспензияси битта пробиркага қуйилади. Лимфоцитлар суспензиясини + 4оС ҳароратда 1 суткадан ортиқ сақлаш мумкин эмас. Лимфоцитларнинг тадқиқ қилинаётган биологик муҳит билан инкубацияси.

2-3 та тоза пробиркага 6-7 мл дан тадқиқ қилинаётган биологик муҳит (плазма, донорлик қони зардоби ёки бошқалар) қуйилади, у HBV, HCV ёки HIV билан зарарланганлик бўйича ИФТ ёки ПЗР тестдан ўтказилади.

 

Ҳар бир пробиркага 500-600 мкл дан соғлом одам лимфоцитлари суспензияси қўшилади, пробиркалар таркиби яхшилаб аралаштирилади ва 370С да 6-8 соатга термостатга қўйилади. Ҳар 0,5-1 соатда пробиркалар таркиби чайқатилади ва аралаштирилади. Инкубация жараёнида тадқиқ қилинаётган биологик муҳитда вируслар мавжуд бўлганида, улар ўзининг лимфотроп хусусиятлари туфайли  мембрана юзасида адгезияланади ва лимфоцитлар цитоплазмасига ўтади.

Инкубациядан кейин пробиркалар термостатдан олинади, уларга 2 мл дан физиологик эритма қўшилади, аралашма аралаштирилади ва центрифугланади. Центрифугланганда лимфоцитлар пробиркалар тубига чўкади.

Центрифуглашдан кейин барча пробиркалардан чўкинди усти суюқлиги олиб ташланади, чўкиндилар битта пробиркага ўтказилади. Кейин лимфоцитлар икки марта физиологик эритмада ювилади.

Охирги центрифуглашдан кейин пробиркадан чўкинди усти суюқлиги олиб ташланади, тарбикида лимфоцитлар бўлган чўкинди 600 мкл физиологик эритма билан суюлтирилади ва эпиндорфга ўтказилади. Эпиндорф совутгичнинг музлатиш камерасига қўйилади. Секин музлатилганда лимфоцитлар мембранаси парчаланади ва цитоплазма таркиби эритмага чиқади.

17-18 соат ўтганидан кейин эпиндорф музлатиш камерасидан олинади, хона ҳароратида эритилади.

Эпиндорф таркиби HBV, HCV ёки HIV маркерлари бор-йўқлигига ПЗР ёки ИФТ тадқиқотдан ўтказилади.

Ушбу метод вирусларни18-20 мл биологик муҳитдан 500 мкл ҳажмда концентрациялаш, ИФТ ёки ПЗР методининг сезгирлик чегарасидан юқори бўлган вирус зарраларининг титрини ошириш имконини беради. Биологик муҳитларни (плазма, донорлик қони зардоби ва бошқалар) HBV, HCV ёки HIV га зарарланганлик бўйича тестдан ўтказганда ИФТ ёки ПЗРда сохта салбий натижаларни истисно қилишга кўмаклашади.

 

 

 

VI   HBV, HCV ва HIV ЛИМФОТРОП ВИРУСЛАРНИНГ ЯШАШ ҚОБИЛИЯТИНИ IN  VITRO  БАҲОЛАШ УСУЛИ

HBV, HCV ёки HIV суспензиясини олиш.

Олдиндан маълум юқори вирусли юкламага эга HBV, HCV ёки HIV моноинфекцияларини юқтирган беморларда вируслар суспензиясини олиш учун тирсак венасидан қон олинади. Тоза қондан вирус сақловчи зардоб ажратилади, у HBV, HCV ёки HIV мавжудлигини тасдиқлаш ва вируслар титрларини аниқлаш учун миқдорий ПЗР тадқиқотидан ўтказилади. Вирус сақловчи зардоб музлатилган ҳолатда минусли совутгичда – 25оС дан паст ҳароратда сақланади.

Соғлом одамдан лимфоцитлар суспензиясини олиш.

Соғлом одамлар – кўнгиллилар ИФТ методи ёрдамида HBV, HCV ва HIV ни юқтирганлик бўйича тестдан ўтказилади. Синовларда фақат салбий тест натижаларига эга соғлом одамларнинг лимфоцитларидан фойдаланилади;

Лимфоцитларнинг етарли миқдорда суспензиясини олиш учун соғлом одам (кўнгилли)нинг қони эрталаб оч қоринга тирсак венасидан 30-40 мл миқдорда олинади. Кейин қон 7-8 мл дан таркибида 2 мл физиологик эритма ва 3 томчи гепарин бўлган центрифуга пробиркаларига солинади.  Пробиркадаги аралашма яхшилаб аралаштирилади;

Тоза гепаринлаштирилган қондан лимфоцитларни ажратиш Ф.Ю. Гариб ҳаммуаллифлигидаги (1995) метод бўйича d=1,077 г/мл зичлик градиентига эга фиколл-верографин эритмасида бўлиниш  йўли билан амалга оширилади. Бунинг учун тоза центрифугали пробиркаларга 2 мл дан фиколл-верографин эритмаси қуйилади, унинг юзасига эҳтиётлик билан гепаринлаштирилган қон солинади ва пробиркалар 20 дақиқа давомида 1500 айланма/дақ.да центрифугланади. Центрифуглаш жараёнида қоннинг барча форма элементлари, лимфоцитлардан ташқари, фиколл-верографин градиент қалинлиги орқали ўтади ва шунинг остида туради. Қон плазмаси градиент устида қолади. Градиент қалинлигида лимфоцитларнинг тоза суспензиясидан ташкил топган ўзига хос лойқа ҳалқа (“булут”) ҳосил бўлади. Бу лимфоцитли  ҳалқа эҳтиёткорлик билан пипетка ёрдамида сўрилади ва тоза центрифугали пробиркага ўтказилади;

Кейин лимфоцитлар 10,0 мл физиологик эритмада икки-уч марта ювилади. Таркибида лимфоцитлар бўлган чўкиндилар 500 мкл физиологик эритмада суюлтирилади ва аралаштирилади. Барча пробиркалардаги лимфоцитлар суспензияси битта пробиркага қуйилади. Лимфоцитлар суспензиясини + 4оС ҳароратда 1 суткадан ортиқ сақлаш мумкин эмас. HBV, HCV ёки HIV вирусларининг одам лимфоцитлари цитоплазмасига ўтиш қобилиятини in vitro баҳолаш.

HBV, HCV ёки HIV сақловчи плазма минусли совутгичдан чиқариб олинади, хона ҳароратида эритилади.

Тоза пробиркага автомат пипетка ёрдамида тенг ҳажмда (300 мкл дан) вирус сақловчи плазма ва лимфоцитлар суспензияси ўтказилади, аралаштирилади ва +37оС ҳароратда 6-8 соатга термостатга инкубацияга (вирусларнинг лимфоцитлар билан in vitro инкубацияси) қўйилади. Пробирка таркиби ҳар 1,5-2 соатда чайқатиш йўли билан аралаштирилади. Инкубация пайтида лимфоцитлар цитоплазмасига фақат яшаш қобилиятига эга вируслар киради, улар цитопатоген таъсирни намоён қилади.

Лимфоцитларни плазмадан ювиб ташлаш. Кейин пробирка термостатдан чиқариб олинади. Унга 6-8 мл физиологик эритма қўшилади, аралаштирилади ва 1500 айланма/дақ.да центрифугланади. Бунда лимфоцитларнинг пробиркалар тубига чўкиши юз беради. Чўкма усти суюқлиги олиб ташланади. Кейин физиологик эритмада 2-3 марта ювилади ва  лимфоцитлар чўктирилади.

Охирги центрифуглашдан кейин ва чўкинди усти суюқлиги олиб ташланганидан сўнг лимфоцитлар суспензиясига (чўкинди) 500 мкл физиологик эритма қўшилади ва эпиндорфга ўтказилади.

Шундан сўнг лимфоцитларни парчалаш учун эпиндорф маиший совутгичнинг музлатиш камерасига 17-18 соатга қўйилади. Секин музлатганда лимфоцитлар мембранасининг парчаланиши юз беради.

Эпиндорфдаги чўкинди усти суюқлиги сўриб олинади ва лимфоцитлар цитоплазмаси таркибида олдин беморлар қон плазмасида мавжуд бўлган вирусларнинг ДНК ёки РНКси бор-йўқлигини аниқлаш учун миқдорий ПЗР тадқиқоти ўтказилади. Натижаларни баҳолаш.

Лимфоцитлар цитоплазмасида вируслар РНК ёки ДНКси бор-йўқлиги бўйича ўтказилган ПЗР тадқиқотнинг ижобий натижаси вирусларнинг яшаш қобилияти, яъни in vitro одам лифоцитларига кириш ва у ерда персистенцияланиш қобилияти сақланиб қолганидан далолат беради.

Бу борадаги ПЗР тадқиқотнинг салбий натижаси эса вирусларнинг (уларга вирусларга қарши кимёвий ёки физикавий омиллар билан таъсир кўрсатгандан кейин ) яшаш қобилияти (инактивлаштириш), яъни in vitro одам лифоцитларига кириш ва у ерда персистенцияланиш қобилияти йўқолганидан далолат беради.

 

VII   HBV, HCV  ва  HIV ВИРУСЛАРНИ АНИҚЛАШ ВА УЛАРНИНГ ЯШАШ ҚОБИЛИЯТИНИ БАҲОЛАШ УСУЛИНИНГ ҚЎЛЛАНИШ ДОИРАСИ

Қон қуйиш станциялари: В гепатити (HBV), С гепатити (HCV) вируслари ва одам иммун танқислиги вируси (HIV)ни ИФТ ёки ПЗР методларининг сезгирлик чегарасидан паст концентрациялардаги вирусларни сақловчи биологик муҳитларда (донорлик қони, плазма ва бошқа компонентлар) аниқлашнинг ҳаққонийлик даражасини ошириш учун.

Диагностика лабораториялари: вируслар концентрацияси ИФТ ёки ПЗР методларининг сезгирлик чегарасидан паст бўлган донорлар ёки пациентлар қонида HBV, HCV ёки HIV вируслари бор-йўқлигини тестдан ўтказишда натижаларнинг ҳаққонийлигини ошириш ва сохта салбий натижаларнинг истисно қилиш учун.

Фармацевтика компаниялари: ишлаб чиқарувчилар томонидан турли объектларда вирусларни инактивлаштириш мақсадларида ишлаб чиқиладиган ва таклиф қилинадиган вирусларга қарши кимёвий ва физикавий омиллар таъсиридан кейин HBV, HCV  ёки HIV вирусларининг яшаш қобилиятини баҳолаш учун.

Ушбу усулпациентлар диагностикасида, донорлик қони ва унинг компонентлари HBV, HCV  ёки HIV лимфотроп вируслар билан зарарланганини текширганда хатоликларни истисно қилиш имконини беради. У кимёвий ёки физикавий омилларнинг лимфотроп вируслар яшаш қобилиятига (патогенлик) самарасини холис баҳолаш имконини яратади.

Лимфотроп вирусларни аниқлаш ва уларнинг яшаш қобилиятини баҳолаш усули аналогларга эга эмас.

Ушбу усул Ўзбекистон Ресмпубликаси Соғлиқни сақлаш вазирлиги томонидан рўйхатга олинган

 

Муаллиф: Гулямов  Нариман  Гулямович, тиббиёт фанлари доктори, профессор